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本產品僅供科研實驗，不得用于醫療或食用

免疫印跡(immunoblotting)又稱蛋白質印跡(Westernblotting)，它是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術基礎上發展起來的一種新的免疫生化技術。由于免疫印跡具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現已成為蛋白分析的一種常規技術。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析。
凝膠遷移或電泳遷移率實驗（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一種研究DNA結合蛋白和其相關的DNA 結合序列相互作用的技術，可用于定性和定量分析。這一技術zui初用于研究DNA 結合蛋白，目前已用于研究RNA結合蛋白和特定的RNA 序列的相互作用。

Western blot 檢測	1000元/膜	每張膜1--8樣本，一抗另計
EMSA	2800元/膜	每張膜1--8樣本，包括探針及試劑

WB實驗代測，Western Blot技術服務，免疫印跡代測
南京信帆代做實驗項目:ELISA,免疫組化,免疫印跡Western Blot,放射免疫,實時熒光定量ＰＣＲ,特殊染色,病理學檢測技術服務等等!我們擁有的實驗室,客戶檢測項目均提供實驗室儀器型號,提供操作詳細步驟.歡迎!
Western Blot實驗
成功完成Western Blot檢測，必須滿足4個條件：

凝膠洗脫：轉移期間蛋白質必須從凝膠中洗脫出來，如果蛋白質還截留在凝膠中，將無法在膜上進行分析

吸附到膜上：在轉移過程中蛋白質必須吸附到膜上，如果蛋白不吸附，將無法在膜上進行分析

處理期間仍截留在膜上：在轉移后的處理過程中蛋白質必須保持吸附在印跡膜上

處理過程中可接近：被吸附的蛋白質必須能夠與檢測試劑接觸，如果蛋白質被掩蓋則無法檢測

成功進行WB檢測，則設置合適正確的對照是*的，只要正確設置了這些對照，即可快速和準確的找到WB的問題所在，并保證實驗結果的準確性和特異性！一般需要設置的對照如下：

陽性對照：明確表達檢測蛋白的組織或細胞，用于檢測抗體的工作效率

陰性對照：明確不表達檢測蛋白組織或細胞，用于檢測抗體的特異性

二抗對照：不加一抗，用于檢測二抗的特異性

內參對照：檢測標本的質量和二抗系統

空白對照：不加一抗和二抗；用于檢測膜的性質和封閉的效果

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WB 檢測基本過程

1 、獲取細胞或組織裂解物

1)根據檢測蛋白的位置選擇合適的裂解buffer：

蛋白位置	推薦buffer
全細胞	NP-40 or RIPA
胞漿（可溶性蛋白）	Tris-HCl
胞漿（骨架結合蛋白）	Tris-Triton
膜蛋白	NP-40 or RIPA
核蛋白	RIPA or 核蛋白提取試劑盒
線粒體蛋白	RIPA or 線粒體分離試劑盒

亦可購買商業化的蛋白提取試劑盒來保證標本制備的質量

2)選擇合適的蛋白酶抑制劑，避免蛋白降解，從而保證檢測的準確性！

2 、蛋白定量

常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根據情況將標本保存在-20°C /-80°C備用，進行免疫沉淀（IP）或者直接進行電泳分離蛋白

3 、電泳分離蛋白質

根據待測蛋白狀態確定電泳條件：

待測蛋白狀態	凝膠條件	上樣buffer	電泳buffer
Reduced - Denatured	還原，變性	含β-巰基乙醇或DTT，含SDS	含SDS
Reduced - Native	還原，不變性	含β-巰基乙醇或DTT，不含SDS	不含SDS
Oxidized - Denatured	不還原，變性	不含β-巰基乙醇或DTT，含SDS	含SDS
Oxidized - Native	不還原，不變性	不含β-巰基乙醇或DTT，不含SDS	不含SDS

根據待測蛋白分子量大小確定凝膠濃度

蛋白分子量（kDa）	凝膠濃度（％）
4-40	20
12-45	15
10-70	12.5
15-100	10
25-200	8

4 、轉膜

根據不同的檢測目的和待測蛋白的特性,選擇合適的膜類型。常用的轉移膜類型有:PVDF膜、硝酸纖維素膜（NC膜）和尼龍膜，其中PVDF和NC膜的使用頻率zui高。各種膜的技術參數及比較如下：

	PVDF膜	NC膜	尼龍膜
靈敏度和分辨率	高	高	高
背景	低	低	較高
蛋白結合能力	100-200ug/cm2（適用于SDS存在時與蛋白結合）	80-100ug/cm2	>400ug/cm2
機械強度	強	干的膜易脆	軟而結實
溶劑抗性	強	差	差
使用前是否需要浸潤	100%甲醛潤濕	緩沖液潤濕	緩沖液潤濕
適用染色方法	膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁、考馬斯亮蘭	膠體金、麗春紅、酰胺黑、印度墨汁	不能用陰離子染料
適用檢測方法	顯色法、化學發光、熒光、放射性、化學熒光、快速免疫檢測	顯色法、化學發光、熒光、放射性	顯色、化學發光、放射性
適用范圍	普通蛋白WB、糖蛋白檢測、蛋白質測序、氨基酸分析、重復檢測	普通蛋白WB、氨基酸分析、重復檢測。0.1um膜適用于7kDa以下蛋白	低濃度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸檢測常用
價格	高	較低	低

5 、封閉

去掉膜上多余的非特異性結合位點，降低背景。常用的封閉溶液有：含BSA或者脫脂奶粉的TBST或TBS

6 、一抗孵育

一抗的選擇成功與否，是整個WB實驗成功的關鍵：選擇一抗有以下幾個注意點：

選擇適合檢測標本種屬的一抗（說明書有驗證）

選擇適用于WB實驗方法的一抗（說明書有驗證）

選擇單克隆抗體或者經過親和純化的多克隆抗體

一抗的保存和使用：

根據說明書的要求條件進行抗體的保存；一般需要將抗體分裝后放入-20度保存，避免反復凍融。

抗體的工作液現配現用，在4度保存不要超過2周

根據說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。由于實驗室條件和檢測方法等的差異，說明書推薦的稀釋比例只作參考，需要在說明書推薦的濃度周邊進行多個濃度梯度的實驗檢測，然后選擇信噪比的抗體濃度進行實驗。如果說明書沒有推薦濃度，可進行多個稀釋比例進行摸索*稀釋度（1:100-1:3000）。

孵育條件：推薦4°C孵育過夜（一般大于18個小時），根據抗體親和力不同孵育時間有所區別

內參的選擇和使用：WB 過程監測以及目的蛋白定量的標準！

WB常用內參及其技術參數：

內參名稱	分子量大小	適用范圍
beta-actin	43kDa	胞漿和全細胞
GAPDH	30-40kDa	胞漿和全細胞
Tubulin	55kDa	胞漿和全細胞
VCDA1/Porin	31kDa	線粒體
COXIV	16kDa	線粒體
TBP	38kDa	細胞核

詳情請參考

7 、二抗孵育

根據說明書推薦濃度使用TBST稀釋一抗。如果說明書沒有推薦濃度，可進行多個稀釋比例進行摸索*稀釋度（1:1000-1:20000）。孵育條件一般為室溫1-2小時

8 、底物孵育

選擇顯色或者化學發光底物。一般傾向于化學發光，靈敏度高且背景低，節省抗體用量

9 、結果分析和檢測

凝膠成像系統檢測或者暗室曝光到膠片

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