ACK紅細胞裂解液(ACK Lysis Buffer)【操作步驟】

A、組織細胞樣本的常規(guī)操作

1、制備細胞懸液: 新鮮組織經(jīng)過胰蛋白酶或膠原酶等消化處理，通過適當方法制備成細胞懸液，離心棄上清。

2、裂解：加入3～5倍細胞沉淀體積的ACK Lysis Buffer，輕柔吹打混勻，裂解1～2min。本操作步驟在4℃條件下操作更佳，亦可在室溫下操作。

3、離心：4℃，400～500g離心5min，棄紅色上清。如無低溫離心機本步驟亦可在室溫下操作。

4、如果發(fā)現(xiàn)紅細胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3各一次。

5、洗滌：根據(jù)具體實驗要求加入適量PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液，輕柔混勻重懸沉淀。4℃，400～500g離心2～3min，棄上清，離心步驟亦可在室溫下操作。所加入的PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液的量一般應(yīng)大于細胞沉淀體積的5倍以上。

6、如有必要，重復(fù)上述步驟5一次，共洗滌1～2次。

7、根據(jù)實驗需要用適當溶液重懸細胞沉淀，進行計數(shù)、培養(yǎng)等后續(xù)實驗。

B、組織細胞樣本的快速操作(無需洗滌)

1、制備細胞懸液：新鮮組織經(jīng)過胰蛋白酶或膠原酶等消化處理，通過適當方法制備成細胞懸液，離心棄上清。

2、裂解：加入細胞5倍細胞沉淀體積的ACK Lysis Buffer，輕柔吹打混勻，裂解1～2min。本操作步驟在4℃條件下操作更佳，亦可在室溫下操作。

3、加入15～20ml的 PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液，輕柔混勻。

4、離心：4℃，400～500g離心5min，棄紅色上清，本步驟亦可在室溫下操作。

5、如果發(fā)現(xiàn)紅細胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2～4各一次。

6、根據(jù)實驗需要用適當溶液重懸細胞沉淀，進行計數(shù)、培養(yǎng)等后續(xù)實驗。

C、血液樣本的常規(guī)操作

1、取新鮮抗凝血，400～500g離心5min，離心棄上清。

2、裂解: 加入6～10倍細胞沉淀體積的ACK Lysis Buffer，輕柔吹打混勻，裂解1～5min。本操作步驟在4℃條件下操作更佳，亦可在室溫下操作。(特別提醒：對于鼠的血液，裂解1～2min已經(jīng)足夠，對于人的外周血，宜延長裂解時間至4～5min，并且裂解過程中輕輕搖動以促進紅細胞裂解)

3、離心：4℃，400～500g離心5min，棄紅色上清。如無低溫離心機本步驟亦可在室溫下操作。

4、如果發(fā)現(xiàn)紅細胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。

5、洗滌：根據(jù)具體實驗要求加入適量PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液，輕柔混勻重懸沉淀。4℃，400～500g離心2～3min，棄上清，離心步驟亦可在室溫下操作。所加入的PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液的量一般應(yīng)大于細胞沉淀體積的5倍以上。

6、根據(jù)實驗需要用適當溶液重懸細胞沉淀，進行計數(shù)、培養(yǎng)等后續(xù)實驗。

注意： 對于微量或少量的血液樣本，可以不用第1步操作，加入10倍血液體積的ACK Lysis Buffer進行第2步操作，并在4℃或室溫裂解4～15min。對于鼠的血液，裂解4～5min已經(jīng)足夠;對于人的外周血，宜延長裂解時間至10min，但通常不宜超過15min，并且裂解過程中宜適當搖動以促進紅細胞裂解。

D、血液樣本的快速操作(無需洗滌)

1、新鮮抗凝血中加入10倍體積的ACK Lysis Buffer，輕輕吹打混勻，裂解4～15min。本操作步驟在4℃條件下操作更佳，亦可在室溫下操作。(特別提醒：對于鼠的血液，裂解4～5min已經(jīng)足夠，對于人的外周血，宜延長裂解時間至10min，但通常不宜超過15min，并且裂解過程中宜適當搖動以促進紅細胞裂解。

2、加入20～30ml PBS、HBSS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液，輕柔混勻。

3、400～500g離心5min，棄紅色上清。4℃離心效果更佳。

4、如果發(fā)現(xiàn)紅細胞裂解不*，可以重復(fù)上述步驟2和步驟3一次。

5、根據(jù)實驗需要用適當溶液重懸細胞沉淀，進行計數(shù)、培養(yǎng)等后續(xù)實驗。

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