1、細胞裂解液主要組分有哪些？SDS、NP-40、TritonX-100有何作用？

  答：細胞裂解液一般含有緩沖成分Tris，裂解成分（SDS、NP-40、TritonX-100等），以及蛋白酶抑制劑成分（PMSF等）。

SDS、NP-40、TritonX-100這三種去垢劑的作用是不同的，或者說作用力量強弱不同。

SDS屬于離子型去垢劑，zui厲害，基本可以把細胞*破掉，DNA會釋放出來，裂解液變得很粘稠。

NP-40是很溫和的去垢劑，1%濃度的基本可以破壞掉包膜，而對核膜破壞的作用弱，結合特定的buffer可以獲得胞漿蛋白。

TritonX-100的能力介于NP-40和SDS之間，偏向于NP40，也是常用的細胞裂解液成分之一，在保護蛋白活性方面有一定作用（SDS基本會使蛋白變性失活）。

2、Western 及 IP細胞裂解液、RIPA裂解液、NP-40裂解液、SDS裂解液的用途？

  答：用于普通的Western 、IP或co-IP，我們推薦使用Western及IP細胞裂解液，該裂解液已被國內各大研究機構廣泛使用，用戶普遍反映很好。裂解細胞或組織后，沒有非常粘滯的透明狀DNA團塊形成，不必采用超聲處理等就可以非常理想地用于后續操作。另外該裂解液裂解的產物也適合用于磷酸化，蛋白的Western 檢測。對于某些特殊蛋白的IP，如果發現Western及IP細胞裂解液效果不是非常理想，可以嘗試用RIPA裂解液（強、中或弱）或NP-40裂解液。如果發現IP的時候背景很高，即非特異的蛋白也被IP下來，則需要選用裂解強度較高的裂解液，例如RIPA裂解液（強或中）。如果發現目的蛋白無法被IP下來，則說明裂解液的強度過強，可以使用較為溫和的裂解液如RIPA裂解液（弱）或NP-40裂解液。對于某些難溶解蛋白的Western，如果發現Western及IP細胞裂解液效果不是非常理想，可以嘗試使用裂解強度更高的裂解液，例如RIPA裂解液（強、中）或SDS裂解液。

3、聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理？

  答：聚丙烯酰氨凝膠電泳簡稱為PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的一種常用的電泳技術。聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，聚合過程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有兩種：化學聚合法和光聚合法。化學聚合以過硫酸銨（AP）為催化劑，以四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。在聚合過程中，TEMED催化過硫酸銨產生自由基，后者引發丙烯酰胺單體聚合，同時甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產生甲叉鍵交聯，從而形成三維網狀結構。

PAGE根據其有無濃縮效應，分為連續系統和不連續系統兩大類，連續系統電泳體系中緩沖液PH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應。不連續系統中由于緩沖液離子成分，PH，凝膠濃度及電位梯度的不連續性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有點和效應，分子篩效應，還具有濃縮效應，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。不連續體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為PH6.7的Tris-HCl，分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為PH8.9 Tris-HCl。電極緩沖液是PH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種PH值使不連續體系形成了凝膠孔徑、PH值、緩沖液離子成分的不連續性，這是樣品濃縮的主要因素。

4、怎樣才能把膠跑的非常漂亮，泳道都能很直，上樣的量和灌膠是否很重要，電壓有什么要求？

  答：影響跑膠跑的質量，有以下幾個因素：

1）  電壓，小的電壓會使膠的分子篩效應得到充分發揮。電壓越小，條帶越漂亮，濃縮膠55V，分離膠75V就能跑得很好。

2）  膠的均勻度，膠越均勻，條帶越窄，分離越均勻。倒膠之前，一定要充分混勻，玻璃板一定要干凈，雙蒸水隔離時，一定要比較輕地加上去，避免稀釋上層的分離膠。

5、western blot使用的膜哪種啊，PVDF好還是NC膜，如何選擇？

  答：PVDF膜可重復使用，特別適合蛋白印跡，結合能力較強，但價格比較昂貴。NC膜價格比較便宜，應用較廣，結合牢固性差一些，韌性也不如PVDF，不能重復使用，但蛋白吸附容量高，親水性較好。都可以用麗春紅染色。

6、請問一下PVDF膜和硝酸膜結合蛋白的原理是什么？

  答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質相聯，這樣的話，反復洗幾次后，蛋白容易掉下來，結果較差。PVDF膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合，同時也有疏水作用，但相對較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢固，不易脫落，結果較好。

7、加甲醇的目的是什么？

  答：加甲醇起著一定的固定作用，因為小分子蛋白質容易轉出去。（特別是在硝酸纖維素膜上，因為NC膜結合蛋白質的能力較弱）。

8、我想盡量提高轉膜的效率（我的實驗要求轉到膜上的蛋白越多越好，不管是什么大小的蛋白）不知道有哪些辦法？

  答：不管怎么轉都會存在蛋白轉移不*（電壓過小、時間過短）或過度轉移（電壓過大、時間過長）的問題，魚（小分子量）和熊掌（大分子量蛋白）不可兼得。建議把膠切成兩半，比如以35KD為界，分別進行轉膜，下半時間短，上半時間長一點，應該會好一些。

9、Western blot中濕轉和半干轉的方法區別？

  答：半干式轉膜速度快，而濕式成功率高并特別適合用于分子量大于100KD的蛋白。

10、半干轉是否要求膜，濾紙，膠同樣大小？因為膠大小不一定規則，膜和濾紙會大一點，那樣會不會短路？什么是短路？如何控制和發現短路呢？

  答：可以相等，但是如果膜比凝膠大就比較容易形成短路了，上下兩層濾紙也不能因過大而相互接觸，這樣同樣會短路，電流不會通過膠和濾紙。轉移前和轉移過程中看看電壓就行，正常的半干是慢慢變高的，zui后結束時一般是開始的1.5-3倍都是正常的。一般buffer和濾紙選的對就不會短路。

11、麗春紅（Ponceau S）染色的原理及特點？

  答：麗春紅染色（Ponceau S Staining Solution）可以用于PVDF膜、硝酸纖維素膜和醋酸纖維素膜上的蛋白的檢測。麗春紅帶負電荷，可以與帶正電荷的氨基酸殘基結合，同時麗春紅也可以與蛋白的非極性區結合，從而形成紅色的條帶。麗春紅對蛋白的染色是可逆的，染色后可以用蒸餾水，PBS或其它適當溶液洗去。

12、如何更的監測轉膜效率呢？

  答：立春紅（也包括考染膠）的靈敏度和HRP-ECL體系的靈敏度相差太遠，即使立春紅染膜無顏色，也無法提示WB結果會不會失敗（考染膠無顏色也不能說明轉膜充分了，除非你銀染），你仍然得繼續后面的操作；相反靶蛋白區域有顏色，亦無法提示靶蛋白就轉膜*了，也許只是另外一個分子量大小相近的蛋白。因此，無論立春紅染膜失敗或成功，你都必須進行后續的操作。而立春紅染膠不僅增加額外的操作時間，而且增加一輪漂洗的操作，對膜和膜上的蛋白都不好。

除了立春紅染色外，你還可以選擇預染Marker來監測你的轉膜效率。理論上，同時轉膜、顏色是交聯到蛋白上的，因此顏色有多深表明有多少蛋白轉印到膜上，非常直觀、不會增加任何額外的操作（固定marker的上樣量非常必要）。

13、抗體孵育緩沖液的選擇？

  答：某些實驗室傳統上在封閉液中孵育抗體，而有些實驗室用不含封閉劑的TBST來孵育抗體，結果因抗體而異，有時兩者結果相同，有時結果不同。如果不存在高背景的問題，某些抗體用含低濃度(0.5 – 0.25%)脫脂奶粉或 BSA的封閉液來稀釋，可產生相對更強的信號條帶。

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