生物通報(bào)道 藥物治療的前提是它們與細(xì)胞靶點(diǎn)的物理結(jié)合。這種結(jié)合的測(cè)定往往是在體外進(jìn)行，無(wú)法充分模擬細(xì)胞內(nèi)的復(fù)雜環(huán)境。Promega的科學(xué)家近日開(kāi)發(fā)出一種新方法，可直接評(píng)估活細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)作用的動(dòng)態(tài)過(guò)程。這項(xiàng)成果于近日發(fā)表在《Nature Communications》期刊上。

闡釋小分子調(diào)節(jié)劑如何與細(xì)胞內(nèi)的靶點(diǎn)結(jié)合，對(duì)了解藥理機(jī)制十分關(guān)鍵。除了靶點(diǎn)作用（target engagement）的特異性和親和力，非平衡條件的結(jié)合動(dòng)力學(xué)也決定了候選藥物的治療潛力。這些參數(shù)通常是通過(guò)生化方法來(lái)評(píng)估的，但無(wú)法充分模擬細(xì)胞內(nèi)的復(fù)雜性。出于這個(gè)原因，制藥行業(yè)一直希望在完整細(xì)胞內(nèi)評(píng)估靶點(diǎn)作用。

Promega的科學(xué)家利用NanoLuc技術(shù)開(kāi)發(fā)出一種新方法，可測(cè)定活細(xì)胞中的靶點(diǎn)停留（target residence），作為靶點(diǎn)作用的重要方面。這種技術(shù)利用生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移（BRET），允許實(shí)時(shí)測(cè)定活細(xì)胞內(nèi)藥物與蛋白靶點(diǎn)的結(jié)合。

為了檢測(cè)藥物-靶點(diǎn)的相互作用，NanoBRET技術(shù)采用細(xì)胞通透性的熒光示蹤劑，旨在與NanoLuc標(biāo)記的蛋白靶點(diǎn)相互作用。這種相互作用的結(jié)果是NanoLuc蛋白的能量轉(zhuǎn)移到示蹤劑上，產(chǎn)生一種可測(cè)量的信號(hào)。

如果小分子候選藥物與蛋白靶點(diǎn)相互作用，示蹤劑就需要和藥物競(jìng)爭(zhēng)，這樣BRET信號(hào)減弱。藥物停留時(shí)間的測(cè)定依賴于化合物的預(yù)平衡、過(guò)量化合物的去除，以及示蹤劑的添加。實(shí)時(shí)信號(hào)監(jiān)測(cè)顯示，緩慢解離的化合物阻礙示蹤劑的結(jié)合，使得BRET信號(hào)緩慢產(chǎn)生。

直接測(cè)定靶點(diǎn)作用

在藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中，測(cè)定細(xì)胞中蛋白靶點(diǎn)與藥物的結(jié)合并將這種靶點(diǎn)作用與藥理作用相關(guān)聯(lián)是十分重要的。NanoBRET技術(shù)為直接評(píng)估靶點(diǎn)作用提供了一種簡(jiǎn)單的方法。英國(guó)癌癥研究中心曼徹斯特學(xué)院的Graeme Walker表示：“NanoBRET系統(tǒng)讓我能夠在活細(xì)胞中直接測(cè)定抑制劑的作用，我很期待將這種技術(shù)應(yīng)用到其他靶點(diǎn)。”

測(cè)定靶點(diǎn)停留時(shí)間

NanoBRET技術(shù)一個(gè)更大的好處在于能夠測(cè)定靶點(diǎn)停留時(shí)間，這是藥物與蛋白相互作用的持續(xù)時(shí)間。這讓研究人員能夠優(yōu)化藥物，以便增強(qiáng)作用。Walker補(bǔ)充說(shuō)：“NanoBRET技術(shù)在保持細(xì)胞完整的同時(shí)，采用一種簡(jiǎn)單的方法來(lái)測(cè)定化合物的停留時(shí)間。這種能力讓我們團(tuán)隊(duì)能夠闡釋探針的新作用機(jī)制。”

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